[00336473]冬凌草总黄酮抗脑缺血作用研究

脑缺血是缺血性脑血管病（ICVD）,由脑局部供血中断或不足引起的脑局灶性功能性障碍。临床表现主要是脑脉痹阻所引起的脑髓神机受损从而出现言语謇涩或不语、偏身麻木、半身不遂、口舌歪斜、甚至出现神志障碍、死亡等症状。缺血性脑血管病的发病率、致残率、病死率、复发率都很高,随着我国老龄化人口的不断增多,脑血管疾病的发病率将会不断升高,其危害也越来越严重。目前,药物对缺血性脑损伤的干预治疗已成为社会和医学本研究团队提出用清热解毒兼活血化瘀法治疗脑缺血,此法既融合了近代”解毒通络法”治疗脑缺血的新理论;又解决了“活血化瘀法”治疗缺血性中风肢体废用不能改善和控制的问题。世界关注的重要研究课题,寻找有效的治疗药物来防治脑缺血的研究越来越得到重视。冬凌草味苦、甘,微寒,归肺、胃、肝经,具有清热解毒,活血止痛之功。 我们前期对冬凌草进行了大量研究,发现冬凌草醇提取物可显著提高小鼠常压及减压耐缺氧能力;对小鼠脑缺血、小鼠血瘀性脑缺血模型均有很好的改善作用,可改善血液流变学指标、改善脑部能量代谢;对小鼠脑缺血再灌注、大鼠脑缺血也有很好改善作用,可减轻脑组织损伤、改善脑组织能量代谢、改善炎性因子水平等。但抗脑缺血具体活性成分还不明确,及其作用的特点和机制有待进一步研究。 本项目通过优化冬凌草总黄酮的提取和纯化工艺;通过观察冬凌草总黄酮对小鼠脑缺血再灌注模型、大小鼠局灶性脑缺血再灌注模型及大小鼠脑缺血耐受模型的影响,期望观察到冬凌草总黄酮的作用特点和机制,为临床应用冬凌草干预和治疗缺血性脑中风提供依据,亦为开发疗效优良的治疗脑缺血综合症药物奠定实验基础。 以下为具体的实验方案： 1)选出最佳的冬凌草的提取纯化工艺 将冬凌草粉碎为粗粉,加10倍量的石油醚回流萃取2次,每次1h,挥干石油醚,冬凌草药渣加10倍量的50％乙醇回流提取2次,每次1h,合并两次醇提液,减压浓缩至无醇味,用蒸馏水分散（浓度为0.3g药材/ml）,作为样品溶液。过AB-8大孔吸附树脂柱进行纯化,上样流速为2.0mL/min,树脂柱径高比为1：10,上样量与树脂体积比为1：10,以2倍树脂体积的蒸馏水清洗树脂柱后,先用4倍柱体积10%乙醇洗脱除杂,再用5倍柱体积的60%乙醇洗脱,洗脱流速为1.5mL/min,收集60%乙醇洗脱液,减压回收乙醇,冷冻干燥,得冬凌草总黄酮。 2)冬凌草总黄酮质量标准研究 本研究参照2010版《中国药典》,对冬凌草总黄酮提取物中的干燥失重、炽灼残渣等进行检查,采用原子吸收法对样品的重金属进行了研究,并对总黄酮进行含量测定,纯度达到55%以上。达到了国家规定标准。 3)冬凌草总黄酮抗脑缺血作用研究 冬凌草总黄酮可显著改善实验大、小鼠神经功能缺失评分,减少梗死面积,明显减轻缺血损伤,改善大脑皮质及海马区的病变情况;减轻因酸度过高对脑组织的损伤,降低因能量代谢障碍对脑组织的损伤;通过清除自由基,抑制脂质过氧化作用,从而减轻脑缺血再灌注损伤程度;抑制缺血后炎症反应,及改善炎症引起的一系列级联反应介质和细胞因子,从而对脑缺血再灌注损伤起到保护作用。 4)冬凌草总黄酮提高脑缺血耐受作用研究 冬凌草总黄酮通过改善脑缺血耐受模型大鼠神经功能缺失评分,减少梗死面积,改善大脑组织皮质及海马区神经元的损伤程度;诱导产生低浓度的细胞因子TNF-α、IL-1β刺激机体产生内源性的保护机制,明显减轻缺血损伤提高神经元的抗损伤能力;降低IL-8含量,抑制炎症反应;升高脑组织中Bcl-2 蛋白含量,降低Bcl-2 相关蛋白Bax含量,降低NF-κBp65的表达,抑制半胱氨酸蛋白酶3（Casp-3）活性,抑制神经元细胞的凋亡;减少NSE释放,保护神经元细胞完整性;升高脑组织中神经营养因子BDNF、GDNF蛋白表达,保护神经元细胞,直接抗脑缺血损伤。冬凌草总黄酮通过诱导产生低浓度的细胞因子刺激机体产生内源性的保护机制,促进神经营养因子表达,升高抗细胞凋亡蛋白含量,降低促细胞凋亡蛋白含量及抑制核转录-κB蛋白表达,从而抑制细胞凋亡,保护神经元;改善大脑皮质及海马区的病变情况,减少梗死面积,明显减轻缺血损伤,提高了机体对缺血缺氧的耐受性。