[00335809]酱油中氨基甲酸乙酯及其前体的生成机制与控制技术

1、课题立项背景： 中国传统发酵食品已有千年的历史。发酵食品加工过程中由于微生物对各种含氮化合物的不完全代谢而生成的胺（氨）类物质,如氨基甲酸乙酯、亚硝胺类和生物胺类等是影响发酵食品安全的重要因素。其中,氨基甲酸乙酯是影响范围最广的一种,广泛存在于多种发酵食品如酱油、食醋、泡菜、腐乳和酒精饮料中。氨基甲酸乙酯具有一定的神经毒性、强烈的肺毒性和较强的致癌性,长期摄入微量的氨基甲酸乙酯也会显著增加各种癌症的发病率。氨基甲酸乙酯的存在,严重影响了我国传统发酵食品的安全性,限制了我国传统发酵食品的出口贸易和食品文化影响力。 2、研究目的与意义： 传统发酵食品中存在的氨基甲酸乙酯与传统的原料、生产工艺以及微生物生理和代谢特性密切相关,是我国特有的食品安全问题。通过混菌体系中微生物组成解析和它们对氮源利用分析,系统揭示导致有害氨（胺）类合成、积累相关的微生物代谢途径及其调控机制,采用食品安全级手段消除以氨基甲酸乙酯为代表的有害（胺）类代谢物积累的分子基础,为解决由于微生物代谢产生的含氮有害物积累导致的食品安全问题提供依据和技术支撑,对于提升我国传统发酵食品安全性、打破国际市场针对我国传统发酵食品行业设置的技术壁垒、传承和发展中国特色饮食文化,具有重要的理论和实际意义。 3、主要论点与论据： （1）通过分析化学方法确定了酱油中氨基甲酸乙酯的前体有瓜氨酸和尿素,并证实了瓜氨酸是酱油中氨基甲酸乙酯的主要前体。 （2）利用高通量筛选的方法,从成曲和发酵不同时期的酱醪中筛选并获得了80株具有精氨酸利用能力而瓜氨酸生成率不同的细菌菌株,奠定了寻找酱醪中瓜氨酸主要积累菌和控制瓜氨酸含量微生物的研究基础。 （3）从基因水平和菌株表现型证实了酱酪中瓜氨酸的产生和积累途径是细菌的精氨酸脱亚氨酶途径。证实了酱油发酵前期（乳酸发酵时期）嗜酸乳酸足球菌是瓜氨酸的主要产生和积累菌,并阐明了盐胁迫是该类菌由精氨酸生成瓜氨酸的转化率提高的主要因素。 （4）揭示了酱油发酵中后期（乙醇发酵时期）氨基甲酸乙酯前体瓜氨酸的积累机制：酱醪中乙醇的生成促进了体系中游离脂肪酸的溶解,使得瓜氨酸想细菌胞外转运效率提高,造成体系中瓜氨酸的积累。通过模拟这一时期发酵条件,证实了酱油发酵中后期葡萄球菌对酱醪中瓜氨酸的积累起主要作用。 （5）采用高通量筛选的方法,获得了一株利用精氨酸不积累瓜氨酸的解淀粉芽孢杆菌JY06,并通过诱变进一步提高了该菌对精氨酸的利用能力和减低瓜氨酸水平的能力。 （6）应用解淀粉芽孢杆菌JY06,进行了8批工业酿造试验,实现了低产氨基甲酸乙酯及其前体瓜氨酸的酱油发酵过程。 4、创新点： （1）本项目确定了酱油中EC的主要前体是瓜氨酸;确定了酱油中瓜氨酸的产生时期是乳酸发酵时期和乙醇发酵时期。 （2）本项目明确了鲁氏结合酵母在代谢过程中不利用精氨酸,证实了它们不会通过降解精氨酸积累氨基甲酸乙酯前体尿素和瓜氨酸。 （3）本项目证实了嗜酸乳酸足球菌在盐胁迫条件下通过ADI途径利用精氨酸并转化生成瓜氨酸是这一时期瓜氨酸积累的主要原因和形成途径。 （4）本项目证实了葡萄球菌是乙醇发酵时期主要的精氨酸利用和瓜氨酸产生的菌株。在此基础上,进一步阐明了乙醇促进的游离脂肪酸溶解度提高是这一时期葡萄球菌和其他细菌利用精氨酸积累瓜氨酸的重要影响因素。 （5）本项目通过高通量筛选的方法,成功筛选出一株具有高精氨酸利用能力但又不积累瓜氨酸的解淀粉芽孢杆菌JY06,并实现了工业规模应用。 5、社会经济效益： 酱油是以大豆和小麦为原料的发酵调味品,在亚洲是最为重要的传统发酵调味品之一。我国酱油年产量约950万吨,酱油产业是我国调味品行业的第一大产业和重点产品。酱油生产过程中的氨基甲酸乙酯形成过程具有很强的代表性,涉及细菌对氮源利用的作用过程。项目成果中建立的采用基于酱醪体系自有微生物干预的策略,不对生产菌株进行基因工程改良,对酱油生产过程无需进行特别的改造,易于在酱油生产企业中推广应用。此外,具有特定物质代谢功能菌株的高通量筛选方法和微生物干预减少有害物的方法,也可以适用于其他类似的传统发酵食品的生产过程中,推广应用前景广阔。