[00336245]VEGF/EGFP转基因骨髓基质细胞移植治疗脑出血的实验研究

本研究采用IV型胶原酶经微泵注入尾状核方法制作大鼠脑出血模型。采用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法分离纯化MSCs,并应用VEGF-EGFP体外转染、筛选、扩增MSCs。采用转染后的MSCs移植治疗大鼠脑出血。 脑出血造模成功后后,Wistar大鼠80只随机分为：假手术对照组20只,脑出血造模组20只,MSC治疗组20只和VEGF-MSC治疗组20只。对于细胞治疗组,在脑出血造模后的48h和7天后,分别使用立体定位仪定位大鼠头骨前囟门并且注射MSC或VEGF-MSC单细胞悬液（5×105 cell/μL）2次。注入速度1 μL/min,总体积2 μL。5分钟后撤出注射器。分为注射MSC组（20只）和VEGF-MSC组（20只）。假手术模型组和脑出血组不注射。移植4周后,进行神经行为学检测;观察分析移植后脑组织冰冻切片并检测移植细胞的分布。分析计算脑组织实时定量PCR。 计量资料用Levene法进行方差齐性检验;若方差齐性,数据以mean ± SD表示,采用重复测量的多因素方差分析进行检验,若分组因素起显著性作用,进一步采用LSD法进用(SPSS14.0（SPSS Inc, Chicago, IL）软件进行统计分析。行每个时间点上的两两组间比较,组间比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。通过本研究证实：通过密度梯度离心结合贴壁培养法可以获得较纯化的MSCs;可成功构建了VEGF-EGFP满病毒,并在哺乳动物细胞和间充质干细胞转染并稳定表达。移植转染VEGF-EGFP的MSC细胞后,脑出血大鼠神经功能明显改善。转染VEGF-EGFP的MSC细胞在脑组织内的分布显著增多;脑出血损伤后VEGF-MSC和MSC治疗均可降低脑组织炎症和氧化应激反应,而VEGF-MSC治疗尤为显著。 创新点： 1、应用VEGF-EGFP体外转染、筛选、扩增MSCs,成功构建VEGF-GFP满病毒。 2、骨髓基质细胞能够促进中枢神经系统修复。但单纯MSCs移植疗效并不理想。血管内皮生长因子（VEGF）是涉及血管发生和发展的肽类细胞因子,具有刺激新生血管形成和促进神经干细胞增殖的双重效应,并在这两者之间起着重要的枢纽作用,在血管发生和形成过程中发挥着重要作用。野生型绿色荧光蛋白的突变型（EGFP）,与GFP相比其荧光强度增加了35倍,大大提高了检测灵敏度。 3、采用VEGF-EGFP转基因的MSCs移植治疗脑出血,在促进神经再生同时又加速局部新生血管生成,满足神经再生过程的营养需要。又能够清楚观察出MSCs在脑内的迁移、存活、分化及新生的神经元。目前国内尚无相关方面的研究。 技术指标： 1、细胞移植4周后,对脑出血大鼠进行神经行为学检测。 2、观察分析细胞移植后脑出血组织冰冻切片,检测移植细胞的分布。 3、分析计算脑组织实时定量PCR（IFN-γ, IL-17、TNF-α、IL-10、HO-1、Nrf 2）。 目前已完成上述研究任务,已发表中华级文章1篇。