[00335773]CCR3基因在变应性鼻炎嗜酸性粒细胞中的作用实验研究

本课题首次运用构建慢病毒载体经鼻腔进行RNAi沉默CCR3对变应性鼻炎嗜酸性细胞作用中的影响研究,实验研究结果如下:1)成功构建了shRNA-mCCR3慢病毒载体, Q-PCR测定对嗜酸性细胞CCR3基因沉默效率为86.7% 2)成功进行了小鼠骨髓细胞的分离及嗜酸性细胞的培养,运用慢病毒介导RNA干扰抑制CCR3基因在嗜酸性细胞上的表达,观察其对小鼠嗜酸性细胞增殖和凋亡的影响,发现RNAi靶向沉默CCR3基因对嗜酸性细胞具有生长抑制作用并能诱导其凋亡。 3)采用鼻腔局部给药,将体外合成的特异性CCR3siRNA重组穿梭质粒（pLVX-ShRNA2-mCCR3-1+2+3+4） 应用于小鼠变应性鼻炎模型上,应用逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法分别检测小鼠骨髓、外周血及鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞CCR3及颗粒蛋白mRNA的表达水平,发现针对基因CCR3,给予RNAi 技术的靶向治疗能够抑制变应性鼻炎动物模型中嗜酸性粒细胞的发育、迁移及浸润过程,从而减少嗜酸性粒细胞脱颗粒作用,从而达到减轻变应性鼻炎的炎症反应。4)经鼻腔给药,将在体外实验中获得的针对CCR3基因抑制效果最明显的特异性CCR3siRNA 重组质粒载体应用于小鼠过敏性鼻炎模型上,借助HE 染色及瑞氏染色分别检测小鼠鼻腔黏膜病理变化以及骨髓、外周血、鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞比例的改变,发现给予RNAi 技术的靶向治疗能够缓解过敏性鼻炎动物模型中鼻黏膜的Ⅰ型变态反应以及减少动物骨髓、外周血及鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞的数量。5)运用RT-PCR和western blot方法分别检测各组小鼠骨髓、外周血及鼻腔黏膜中EOS的CCR3基因mRNA及蛋白的表达情况,采用流式细胞仪检测各组小鼠CD34+细胞的变化情况发现RNAi慢病毒载体沉默CCR3基因,在细胞培养和变应性鼻炎动物模型中都能有效的影响CCR3基因mRNA和蛋白水平的表达,促进EOS凋亡并抑制其发育、迁移及浸润过程。 在前期国自然的研究基础上,考虑RNAi技术的沉默效率,随着基因敲除技术的成熟并且较RNAi优势,为此我们进一步通过基因敲除CCR3对嗜酸性粒细胞的影响研究,结果发现：1)敲除CCR3小鼠的构建及鉴定,并成功构建敲除CCR3基因小鼠模型,为后续的体内外实验奠定了前期的基础。2)利用CCR3基因敲除小鼠与野生型小鼠,检测其骨髓体外培养嗜酸性粒细胞与正常小鼠之间增殖和凋亡以及脱颗粒蛋白之间的差异,发现敲除CCR3基因可抑制EOS增殖及成熟,促进其凋亡。3)通过观察CCR3基因敲除小鼠及野生型小鼠在变应原作用下鼻粘膜病理变化及骨髓、外周血及鼻腔灌洗液中嗜酸性粒细胞颗粒蛋白的差异,发现对过敏原的刺激,基因敲除CCR3小鼠与普通小鼠相比鼻部症状不明显,鼻黏膜病理改变明显减轻,且基因敲除CCR3小鼠致敏组与普通小鼠致敏组相比在小鼠骨髓、外周血及鼻腔灌洗液中EOS颗粒蛋白mRNA及蛋白量 的表达量明显减低。本实验验证CCR3基因在变应性鼻炎疾病的发病发展及治疗方面具有重要作用,可进一步在临床实践中开发利用。本项目的顺利完成为进一步开展变应性鼻炎靶基因CCR3相关系列研究打下良好的科学实验基础。