[00335627]ALA光动力治疗β-HPV感染的非黑素瘤性皮肤癌作用机制的研究

本项目研究收集非黑素瘤性皮肤癌患者ALA光动力进行疗效分析。建立非黑素瘤性皮肤癌（皮肤鳞状细胞癌,基底细胞癌,表皮原位癌）的传代细胞株、取非黑素瘤性皮肤癌细胞株A431和SCL-1,使用MTT法检测不同浓度的5-ALA激光照射后,非黑素瘤性皮肤癌传代细胞株存活率的变化;并使用Annexin V-FITC/PI标记细胞通过流式细胞仪检测5-ALA光动力疗法前后细胞凋亡的变化。采ELASA,Westen,RP-PCR, MTT法和流式细胞仪检测等不同的实验检测方法从细胞分子水平上进一步研究5-ALA光动力疗非黑素瘤性皮肤癌中关于MAPK信号通路及细胞凋亡自噬和细胞凋亡三者之间的关系,并探究5-ALA光动力治疗非黑素瘤性皮肤癌的分子机制及信号网络,以进一步深化ALA光动力疗法抗癌机制理论基础,并积极寻找治疗新靶点,为新的光敏药物研发提供实验数据及理论依据。 本项目所取得的成果：（1）收集非黑素瘤性皮肤癌组织,对阳性标本进行β-HPV分型,发现与正常组织相比,皮肤鳞状细胞β-HPV感染率最高,具有差异统计学意义。（2）对β-HPV阳性的皮肤鳞癌进行特异性分型,主要检测目前研究较多的HPV5,8,15,17,19,21,23,36,38,80,结果发现皮肤鳞癌中HPV检出率最高,其中HPV-38感染率达到65.52%,提示其可能是具有关键致癌作用的β-HPV亚型。（3）对所选患者84例采用ALA光动力疗法进行治疗,发现所选患者经治疗6个月后,总有效率为90.48%,其中日光性角化病、疣状癌的有效率均为100%,基底细胞癌、鳞状细胞癌、鲍温病、Paget病的有效率分别为92.31%、82.35%、90.91%、87.50%,其中有13例患者出现复发,复发率为15.48%。（4）体外建立培养非黑素性皮肤癌细胞株A431,完成5-ALA-PDT对A431肿瘤细胞凋亡、细胞周期、细胞自噬以及对相关细胞凋亡的信号通路的影响的检测,选用不同浓度的5-ALA（0,5μM,10μM,15μM）处理A431细胞24小时后,发现5-ALA-PDT可显著抑制A431细胞增殖;可显著诱导细胞凋亡;可显著增加PARP剪切体的产生,说明5-ALA-PDT可通过激活PARP剪切体的产生,来诱导细胞凋亡,并呈浓度依赖性;并且可显著使细胞停滞在S期和G2/M期,可显著抑制cycD1和cycE1蛋白的表达,说明5-ALA-PDT可通过停滞细胞周期,来诱导细胞凋亡。（5）使用Western Blot检测5-ALA-PDT对细胞自噬的标记蛋白LC3B和Beclin-1影响,结果显示其可显著增加Beclin-1蛋白和LC3B-Ⅱ蛋白的表达,说明5-ALA-PDT可诱导细胞自噬的产生。（5）使用流式细胞术检测5-ALA-PDT对ROS影响,结果显示其可显著增加ROS的产生,说明5-ALA-PDT可诱导ROS的产生;使用Western Blot检测其对PARP蛋白的影响,结果显示清除ROS可显著减弱PARP剪切体的产生,说明5-ALA-PDT通过ROS产生诱导的细胞凋亡。（6）使用Western Blot检测ROS清除剂NAC对自噬体标记物--LC3B蛋白的影响,结果显示清除ROS可显著减弱LC3B-Ⅱ的产生,本实验说明5-ALA-PDT通过ROS产生诱导的细胞自噬。（7）使用Western Blot检测5-ALA-PDT对信号通路的影响,结果5-ALA-PDT可显著激活AKT信号,在使用ROS清除剂的情况下,可显著减弱5-ALA-PDT对AKT信号的激活;进一步使用PI3K/AKT的抑制剂LY294002可显著增加5-ALA-PDT对细胞的抑制,同时减弱LC3B-Ⅱ的产生,说明5-ALA-PDT诱导ROS产生激活AKT信号,进而激活细胞自噬,进一步展示和分析揭示 ALA 光动力疗法抗癌的分子机制。 通过我们研究证实,在A431细胞中5-ALA-PDT通过ROS的产生,增加PARP剪切体的表达,诱导细胞凋亡。ROS可通过激活PI3K/AKT信号激活自噬,拮抗细胞凋亡。同时5-ALA-PDT通过抑制周期蛋白cycD1和cycD1的表达,导致细胞停止在G2/M期,导致细胞凋亡。本研究探究 ALA 光动力治疗β-HPV 感染非黑素瘤性皮肤癌的分子机制及信号网络,明确 ALA 光动力治疗 NMSC 的发病机制可为今后有效预防和早期积极治疗提供重要理论依据,以进一步深化ALA光动力疗法抗癌机制理论基础,并积极寻找治疗新靶点,为新的光敏药物研发提供实验数据及理论依据。 本项目已发表相关核心期刊相关文章11篇,SCI 2篇,参与国外学术会议发言 1次,国内学术会议发言 3次,电子壁报展示2次,2014年获新疆维吾尔自治区人民医院院内科技进步奖,2014年获中华医学会第二十次全国皮肤性病学术年会优秀壁报奖,2016年《Methylation status of SFRPs gene family in cutaneous squamous cell carcinomas》获第十届新疆维吾尔自治区自然科学优秀学术论文、中华医学会皮肤性病分会SCI论文三等奖,2017年获得新疆维吾尔自治区人民医院院级科学技术进步二等奖,培养硕士研究生1名。