[00335241]一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法

一、课题来源与背景 该技术是在“亚热带特色花卉新品种选育”（桂农科2017YZ05）项目的支持下完成的。微斑报春苣苔（Primulina minutimaculata）为苦苣苔科报春苣苔属的多年生草本植物。分布于广西龙州、天等,生于石山林下石上,海拔200-450 m,花期4-5月。微斑报春苣苔在龙州和天等的分布范围虽然较广,但分布零星,且居群小,植株个体数量较少,自身更新困难。此外,由于开山筑路等对生境严重破坏,导致居群迅速退缩,目前已处于濒危状态,IUCN等级为极危。微斑报春苣苔花型独特,叶片具有魅力的斑纹,观赏价值极高,受到国外众多观赏植物爱好者和育种者的广泛关注,是极具开发利用的喀斯特野生花卉。传统的繁殖以种子播种和叶片扦插为主,但繁殖速度慢,繁殖系数小。而组织培养能够在短时间内获得大量遗传性状一致的优质苗,克服了常规繁殖周期长、繁殖系数小的缺点。目前,组织培养在报春苣苔属的其他植物上得到了广泛应用,且多以叶片为外植体,而在微斑报春苣苔上的应用尚未有报道。因此,通过微斑报春苣苔的种子无菌萌发进而进行分化培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽,从而建立微斑报春苣苔的组织培养体系,对其规模化生产和种质资源收集及保存具有积极意义。 二、技术原理及性能指标 2.1种子的无菌萌发 取成熟未开裂的微斑报春苣苔果荚,用洗洁精浸洗10-15min后在流水下冲洗干净10-15min。在超净工作台上先用75%酒精中浸泡果荚30-40 s,无菌水冲洗3-5次,再用0.1%升汞（加吐温）浸泡果荚12-15 min,无菌水冲洗3-5次。在接种盘上切开果荚,并用经过消毒灭菌的勺子轻轻将种子拨入种子萌发培养基中。播种好的种子先在光照培养箱中暗培养至种子萌发（温度17-20℃）,然后再转入培养室中培养（温度23-25℃,光照为1000-1400lx）。萌发培养基为MS+GA31.0-2.0 mg/L+活性炭0.5 g/L。 2.2初代培养 将已经萌发子叶尚未长出真叶的小苗切成子叶、胚轴两部分,然后接入不同的初代培养基中培养40 d。子叶28-32 d可直接诱导出不定芽,并且在子叶基部有愈伤组织产生,不定芽诱导培养基为MS+KT1.0-2.0 mg/L+NAA0.01-0.1 mg/L,愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU（吡效隆）0.1-1.0mg/L+2,4-D1.5-2.0 mg/L。胚轴30 d能诱导愈伤组织,不能直接诱导不定芽,愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU（吡效隆）0.1-1.0mg/L+2,4-D1.5-2.0 mg/L。子叶的不定芽诱导率、愈伤组织诱导率分别为：89.8%-94.5%、85.5%-90.3%。胚轴的愈伤组织诱导率为100.00%。 2.3不定芽的继代增殖培养 将具有1对以上叶片的不定芽切取下来,接入继代增殖培养基中培养26-28 d。培养基为MS+6-BA1.0-3.0 mg/L+IBA0.1-0.30 mg/L+土豆30 g/L+香蕉30 g/L+苹果20g/L+椰汁100ml/L。增殖系数达8.7-9.8,植株长势好,健壮。 2.4愈伤组织的分化培养 将愈伤组织切成1 cm×1 cm的小块接入分化培养基中培养29-30 d。培养基为MS+ZT0.1-1.0 mg/L+IBA0.1-0.3 mg/L+土豆30 g/L+香蕉30 g/L+苹果20 g/L+椰汁100 ml/L。分化系数为10.7-12.1,植株长势好,健壮。 2.5生根培养 当组培芽具有2对以上叶片时,转接于生根培养基中培养23-25 d。生根培养基为1/2MS+IBA1.0-3.0 mg/L+椰汁50 ml/L+活性炭1.0 g/L,生根率100.00%。植株长势好,健壮,根系多。 2.6炼苗移栽 将具有2-3对叶片的生根苗移出培养室,在温室中炼苗10-14 d。洗净培养基移栽到装有基质（泥炭和珍珠岩的体积比为2:1）的50孔穴盘中。浇透定根水后,将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下,透光率为40-50%。移栽7 d后,用1/2MS营养液浇淋,连续淋2次,时间间隔为7 d。移栽后20 d后成活率达100%。1/2MS营养液：MS大量元素减半,其余不减半。 三、技术的创造性与先进性 3.1该技术成功建立了微斑报春苣苔的组织培养体系。 3.2该方法具有种子萌发率高、成苗快、种苗品质好等特点,能在短期内获得大量的组培苗,是微斑报春苣苔种苗生产及资源保护的有效途径。 四、技术的成熟程度,适用范围和安全性 该技术对微斑报春苣苔的组织培养技术进行了研究,包括种子无菌萌发、初代培养、不定芽的继代增殖培养、愈伤组织的分化培养、生根培养、炼苗移栽。该技术安全可靠。 五、应用情况及存在的问题 已在广西农科院花卉研究所得到了应用,获得了组培种苗。该技术对组培设备设施要求高。 六、历年获奖情况 无