[00335181]P21基因在水牛卵母细胞成熟过程中的差异表达和功能分析

一、课题来源与背景 目前,广西实施的良种水牛种源产业化要求广西水牛研究所到 2012年底具有年产良种胚胎3000枚以上的生产能力。因此,提高水牛胚胎体外生产效率显得非常重要。然而,与黄牛相比,目前我国水牛胚胎体外生产效率总体水平较低,卵母细胞体外成熟率接近60％左右,分裂率60％～65％,囊胚率约30％,具有较大幅度的提升空间。卵母细胞作为活体采卵、体外受精、体细胞核移植和转基因克隆等胚胎生物技术研究和应用的基本实验材料。卵母细胞体外成熟培养是胚胎体外生产的上游环节,卵母细胞的成熟好坏直接影响胚胎体外生产的效率和胚胎移植效果。如果通过优化胚胎体外生产体系中的卵母细胞体外成熟环节,将成熟率提高到75％以上,囊胚率提高到35％以上,能够在现有水平的基础上提高5～10％,将对整个良种水牛产业化起到非常重要的作用,对加快广西乃至全国水牛杂交改良进程具有很大的促进作用。 2014年6月广西壮族自治区科学技术厅以立项通知文号：桂财教【2014】118号文件,将项目任务书编号为2014GXNSFAA118116的项目下达给广西壮族自治区水牛研究所,课题研究时间为2014年6月至2017年5月。 二、研究目的与意义 P21是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKIs）,其在细胞周期进程的调控中可与多种生物活性分子相互作用,通过多条信号通路参与细胞的生物学活性。在低等动物卵子中已证实P21可抑制MPF的活性起到调控卵母细胞减数分裂和成熟的作用。目前P21在哺乳动物卵母细胞成熟过程中的分子调控研究报道很少。本项目设想以水牛卵母细胞为试验材料,采用QRT-PCR技术检测P21基因在水牛卵母细胞体外成熟和胚胎发育各时期的mRNA的差异表达;构建P21基因真核表达载体,借助显微注射技术,分析P21基因在水牛卵母细胞中的超表达变化,推测水牛卵母细胞体外成熟过程中P21 mRNA的表达规律和可能的分子调控机制及执行的相关功能。为提高水牛胚胎体外生产效率提供分子生物学理论和实验依据,对加快我国水牛品种改良进程,推进奶水牛产业化发展具有重要作用。 三、主要论点与论据 本项目以水牛卵母细胞为材料,Real-time PCR检测P21在卵母细胞体外成熟和胚胎发育各时期的mRNA差异表达;构建p21真核表达载体,p21过表达对卵母细胞发育的影响。结果表明：在卵母细胞成熟和胚胎发育阶段p21均有表达,呈先升高后下降规律;构建了pEGFP-N1-p21真核表达载体;p21能阻止卵母细胞进入GVBD期,促进M-Ⅱ期退出和原核形成。推测可能与卵母细胞体外成熟过程中基因转录后调控有关。为提高水牛胚胎体外生产效率提供实验依据,对加快我国水牛品种改良进程,推进奶水牛产业化发展具有重要作用。 四、创建与创新 1、成功构建了水牛p21基因真核表达载体pEGFP-N1-p21; 2、首次获得了水牛卵母细胞体外成熟培养0 h （GV 期）、6 h（GVBD 期）、12h（M-I 期）和24 h （M-Ⅱ期）4个时段的水牛卵母细胞中p21 mRNA的表达量,在卵母细胞成熟培养6 h 的p21 mRNA表达量相对较高,表达规律呈先升高后下降的趋势;获得2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚5个胚胎时期p21 mRNA的表达量,4-细胞以后P21 mRNA表达水平下降,表达规律呈先升高后下降的趋势。 五、社会经济效益 ,存在的问题社会经济效益：本项目的实施主要以水牛为载体,不会对环境和生态造成任何负面影响。相反,项目实施为水牛卵母细胞体外成熟发育机制研究搭建了一个新的研究平台,为提高卵母细胞成熟提供了新思路,为今后进一步提高胚胎体外生产效率奠定基础。存在问题：一直以来,许多人误以为水牛和黄牛是同一个物种,很多研究在黄牛上已经取得了成果,就不需要在水牛上开展“重复”的研究,但是水牛和黄牛从基因序列、染色体数目到个体生理调控等方面都存在很大差异。我们在研究过程中发现,即使采用完全相同的程序,水牛卵母细胞的体外成熟效果要远远低于黄牛,目前并不清楚其原因和机制,需要进一步的研究来解决水牛卵细胞成熟率低的问题。 六、历年获奖情况 无 七、成果简介 成功建立了水牛卵母细胞和胚胎总RNA抽提,p21分离、鉴定和扩增方法,构建出真核表达载体pEGFP-N1-p21;获得水牛卵母细胞成熟培养阶段和胚胎发育阶段各时期p21 mRNA的表达量,摸索出表达规律呈先升高后下降的趋势;发表学术论文3篇,其中SCI 期刊收录1 篇,中文核心期刊论文2 篇;申请并受理实用新型专利1项。