[00335105]miR-150调控自身免疫性溶血性贫血CD5+B细胞活性的研究

自身免疫性溶血性贫血（Autoimmune Hemolytic Anemia,AIHA）是免疫性血细胞减少症中常见的疾病,B细胞功能亢进产生大量自身红细胞抗体,结合并破坏自身红细胞,是研究自身抗体介导组织损伤的良好疾病模型。B细胞是一群异质性细胞,据B细胞表面CD5的表达情况,分为两个亚群,即CD5+B细胞,为B1细胞;另一亚群：CD5-B细胞,即B2细胞。B2细胞受外来抗原刺激激活后合成、分泌抗体和细胞因子,产生高亲和性特异性抗体;B1细胞对外源抗原只产生有限的应答,主要对一些自身抗原产生应答。新近研究发现部分B细胞亚群严重影响自身免疫性疾病进程,具有负调控作用,Mizoguchi首次用调节性B细胞（Regulatory B,Breg）命名此类细胞,Breg主要是通过多种自身免疫性疾病动物模型发现,其细胞表面表达CD5分子,最主要的功能特征是分泌IL-10,通过IL-10发挥负调控作用。有必要深入研究CD5+B细胞亚群的生物学特性,了解其与自身免疫性疾病之间的关系。 CD5+B细胞活化的上游受什么因素调控？近期研究显示micro RNA参与调控B细胞的增殖、分化和活化,在自身免疫性疾病中发挥重要作用。miRNA是一类长约21～25个核苷酸（nt）、内源性的非蛋白编码调控RNA,通过与靶基因mRNA 3’端非编码区（UTRs）的完全或不完全互补结合,抑制靶mRNA翻译或降解靶mRNA,使基因在转录后水平产生沉默,调节生物体内的基因表达,在转录后水平对基因进行负调控。miRNA17-92、miR-24、miR-29a、miR146a、miR221、miR155等调控B2细胞;而miR-150主要在成熟淋巴细胞中表达,定位于19号染色体50004130-50004120位点,通过负调控转录因子c-Myb调控成熟CD5+B细胞的增殖和分化。Xiao等用miR150缺陷小鼠证实miR- 150调控T细胞介导的体液免疫反应,并能促进CD5+B细胞的数量明显增高。Charlene等证实miR150通过下调c-Myb的功能调控淋巴细胞的数量和功能。CD5+B细胞在AIHA患者中的数量增高,CD5+B细胞的活化状态如何？miR-150是否也通过转录因子c-Myb调控CD5+B细胞？未见相关报道。 本研究课题用流式细胞仪检测AIHA/Evans及对照组外周血CD5+/-B细胞表面CD80、86、69等活性分子表达,胞内TGF-β和IL-10的表达水平及BTK、p-BTK的表达水平,流式细胞分选CD5+B细胞;用PCR检测了CD5+/-B细胞TGF-β、IL-10及Ig/TCR基因克隆性重排;用ELISA检测患者及对照血清中TGF-β、IL-10水平;采用细胞培养和质粒转染的方法将miR-150高表达质粒、低表达质粒和空白质粒转入B淋巴细胞内,随后用PCR检测B细胞c-Myb基因表达水平并验证其表达相关性;运用基因测序的方法对AIHA/Evans全基因组微小RNA的表达谱进行分析。 通过研究发现：①证明miR-150通过c-Myb调控AIHA患者B细胞,在AIHA免疫发病中发挥重要作用。②发现CD5+B细胞在AIHA患者体内处于活化状态,其细胞表面的活化分子的表达与经典B2细胞不一致,也与CLL患者体内的克隆性CD5+B细胞有差异,证实AIHA患者CD5+B细胞有独特的活性,值得进一步深入研究。③发现AIHA患者CD5+B细胞的BCR活化通路与CLL患者克隆性CD5+细胞的BCR活化通路不尽相同。④AIHA患者虽然体内产生的是多克隆自身抗体,但是其体内能发现发生了克隆性基因重排的B细胞和T细胞,为进一步揭示其与淋巴增殖性疾病之间的关系提供思路。⑤通过基因筛查了AIHA患者B细胞的miRNA的谱系,与健康对照B细胞miRNA进行比对,发现了AIHA患者自身B细胞miRNA表达特征,为深入研究AIHA的疾病特征提供研究基础。 本课题着重研究miR-150对AIHA患者CD5+B细胞的活性调控及调控方式,深入了解miR-150 在以自身抗体介导的组织损伤疾病中作用。AIHA患者外周血CD5+B细胞亚群的活性及活化通路的变化,为进一步研究调节性B细胞提供理论基础。为其它以自身抗体损伤自身组织的自身免疫性疾病提供理论基础,有一定的科学价值。通过对AIHA/Evans及CLL外周血B细胞表面活化分子的检测,发现AIHA/Evans患者外周血CD5+B淋巴细胞表面活化分子的表达与CLL克隆性CD5+B细胞表面活化分子的表达存在差异;了解了自身免疫性疾病和肿瘤之间存在着的不同生物学基础,有一定科学意义。通过研究发现miR-150可能为AIHA的关键调控因素,可能会成为潜在根治和减少AIHA复发的治疗靶点,能造福AIHA患者,减轻患者经济和精神负担,有一定的社会效益和经济效益。 在课题研究期间取得如下成果：①已发表SCI论文2篇,另有1篇待投;已发表核心期刊5篇,另有1篇已投 ②培养硕士研究生3名,博士研究生1名 ③参加了2016年第十四次全国血液学学术会议,全国中、西医结合学会2016年血液学学术会议,中华医学会血液学分会2017年全国红细胞疾病（贫血）学术会议,连续参加了2016～2018年天津市医学会血液学年会;在大会上发言和进行学术交流汇报。