[00334314]一种快速检测农药残留的植物酯酶生物传感器的研制

一、来源与背景 本项目名称为“一种快速检测农药残留的植物酯酶生物传感器的研制”,属于国家质检总局科技计划项目,项目合同编号：2012QK139,项目承担单位为黑龙江省质量监督检测研究院。 二、研究目的与意义 近年来,农药残留问题越来越多的受到人们的关注。尽管国家有关部门三令五申禁止将高毒、剧毒品种用于蔬菜果品的生产,但全国不少地区仍在使用像甲胺磷、对硫磷、氧化乐果和吠喃丹等高毒高残留农药,而且因食用含大量农残的蔬菜所引起的人畜中毒事件也时有发生,带来了严重的食品安全问题。 目前检测果蔬中农药残留的方法主要是依据国家标准利用气相色谱、液相色谱等大型精密仪器来检测,这些方法检测时间长且仪器价格昂贵,需要专业技术人员维护,检测成本高,而且国家标准专业性强、针对性强,有些国家标准在农残检测的方法上没有具体步骤,需要实验室不断摸索实验条件,因此不具备快速检测和广泛应用,尤其是在现场执法检查中,当发现产品中农药残留过高时,该样品往往已销售出一部分或大部分,甚至被消费者食用,无法及时追回,给行政执法带来很多麻烦,不利监管。 农药残留问题虽受到多方关注,但是一直缺乏预防和控制监管措施,大多是出现食物中毒后对食品中农残的问题进行溯源,让质检行业一直处于被动地位,而且我国果蔬产品的产销特点是小规模、分散式的,所以消费者、供应商迫切需要快速检测技术,以控制农药残留问题的蔓延。 其意义：1)解决东北林区高活性的植物酯酶来源尚未确定的问题;2) 解决生物传感器对某一种单一成分的农药残留无法定量分析的问题;3)为行政执法部门提供科学的执法依据;4)为法律部门执法的重要证据。 三、国内外研究概况及国内存在的问题 1、国内研究现状 生物传感技术是当今高科技领域的前沿课题。基于特定酶活性抑制原理设计的酶生物传感器（EBS）在农药残留检测方面很受关注,所用的酶主要为乙酰胆碱酯酶,浙江大学何奕等人报道了快速检测有机磷农药的酶生物传感器的研究,所用的酶是乙酰胆碱酯酶;西南大学寇冬梅报道了快速检测重金属离子的酶膜生物传感器及其应用研究,酶膜的来源于脲酶;魏福祥等人利用乙酰胆碱酯酶催化底物引起微机电化学系统电位变化的原理对生物传感器进行了研究。 2、国外研究现状 Sussman等首次报道了电鳐的乙酰胆碱酯酶催化亚基晶体X射线衍射图谱,对乙酰胆碱酯酶结构和功能关系的进一步解释,以及为生产重组乙酰胆碱酯酶而开发的高效表达系统都推进了乙酰胆碱酯酶作为抑制剂在检测分析方面的应用;Tranmin和Kumaran等人在2000年分别利用用物理方法制的电位型乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶传感器,虽灵敏度较高,但由于酶结合得不牢固,导致生物传感器寿命短,不适合连续的检测工作;Schulze H报道利用重组技术对乙酰胆碱酯酶进行重组,重组后的乙酰胆碱酯酶对有机磷和氨基甲酸酯检测的灵敏度大大提高了,但此技术未见应用到酶生物传感器中。 3、存在的问题 1)目前我国的生物传感器的酶基膜多采用动物脑组织（鳗鱼、家蝇、鸡）中提取的乙酰胆碱酯酶,酶活较低,而且保存时间短,国外如sigama公司生产的乙酰胆碱酯酶主要来源于海洋生物,酶活高出国内酶活的十几倍,但是价格较高,增加了生物传感器的开发成本。本项目利用植物中的植物酯酶,酶活较高,且纯化成本远低于乙酰胆碱酯酶,适合作为酶基膜的来源开发一种新型酶的生物传感器。 2)由于每种有机磷和氨基甲酸酯对乙酰胆碱酯酶的抑制常数是不同的,检测的结果只能给出乙酰胆碱酯酶抑制的总量而没有任何有关分析组分的定性或定量信息。本项目根据每一种有机磷和氨基甲酸酯对植物酯酶不同抑制常数,建立模型和工作曲线,对农药残留进行定量分析。 3)目前对生物传感器的研究大多停留在用一种酶源的乙酰胆碱酯酶测定农药残留,单一酶源的胆碱酯酶并不是对所有有机磷和氨基甲酸酯类农药都敏感,所以用单一酶源检测所有有机磷和氨基甲酸酯类农药残留并不科学,本项目在对不同酶源植物酯酶酶活研究的基础上,并对不同酶源植物酯酶所能检测农药品种的范围进行研究,使酶源的利用更合理、更科学。 四、主要成果 通过对植物酯酶进行固定化以保持其高度活性和高使用率,并利用优选出的植物酯酶制作成优质的酶基膜,将酶基膜固定在电极上,并对其反应时间、反应温度、pH值、底物浓度等影响因素进行研究。建立生物传感器模型后,通过对响应电流变化的分析,筛选出传感器最佳工作条件：pH值6.5的条件下,底物α-乙酸萘酯浓度为0.06mmol/L,给酶量25μL,酶固定化时间8h,抑制时间10min,对样品中的农药残留的加标回收试验结果表明传感器具有较好的稳定性。 形成研究报告1份,发表学术论文2篇。