[00334042]TET/miR-26a/EZH2信号介导的表观遗传修饰在胃癌发生发展中的作用

TET蛋白家族是重要的去甲基化酶,具有催化5mC羟基化的酶活性,可将5mC转化为5-羟甲基胞嘧（5hmC）。前期我们发现DNA去甲基化酶TET家族具有潜在的促癌功能,且受miR-26调控。本项目我们首先在33对胃癌组织及配对癌旁组织中通过qRT-PCR和免疫组化检测TET家族基因的表达水平。结果显示三个TET家族的RNA水平在癌组织较癌旁组织均显著上调,且其表达水平与临床分期有关。通过免疫组化检测TET蛋白及5hmC表达情况发现,胃癌与癌旁组织相比,表达水平并无显著差异。这说明TET家族高RNA水平并不产生高蛋白水平。为进一步研究TET家族的胃癌临床意义,我们检测另一组76对胃癌及配对的癌旁组织样本中TET家族的表达水平。与以前结果一致,TET家族的RNA水平在癌组织较癌旁组织均显著增高。分析TET1/2/3 RNA水平与胃癌临床各参数之间的关系发现,所有三个TET基因的RNA水平均与临床分期正相关,TET2和TET3还与肿瘤浸润深度相关。生存分析发现TET1/3 是胃癌独立的预后因素。 我们建立稳定干扰TET1/2/3表达的胃癌SGC-7901细胞,动物实验结果发现干扰TET1/2/3表达后抑制裸鼠移植瘤生长。接下来通过细胞实验发现,干扰TET1/2/3抑制胃癌细胞SGC-7901和AGS细胞增殖、软琼脂克隆形成能力、侵袭能力。 因所有三个TET基因3’UTR均有多个miR-26的保守结合位点,接下来我们在胃癌中进一步证实了TET1-3是否是miR-26a直接的靶基因。 我们接下来构建TET1-3基因的5’UTR、CDS、 3’UTR表达载体,通过体内外实验发现TET家族诱导胃癌恶性转化依赖于其3’UTR,不依赖CDS序列。通过将3’UTR上中miR-26结合位点进行突变,发现TET家族诱导胃癌恶性转化依赖于miR-26结合位点。 接下来我们在研究TET对EZH2的调控作用中发现,过表达TET1/2/3 3’UTR显示诱导EZH2 mRNA及蛋白表达,突变miR-26结合位点则取消这种作用。过表达TET1/2/3 3’UTR下调EZH2靶基因为E-cadherin 、RUNX3、miR-218表达。过表达TET1/2/3 CDS对EZH2及其靶基因的表达无明显作用。我们发现miR-26a在胃癌中显著下调,且其表达水平与胃癌临床进展、生存时间负相关。此外,体内外实验证实miR-26a抑制胃癌细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制胃癌生长和转移。通过研究靶基因发现FGF9是其直接调控的靶基因,它能部分介导miR-26a的功能。并且我们发现miR-218能抑制胃癌细胞增殖,诱导细胞G1/S期阻滞,抑制胃癌细胞生长及转移。随后机制研究发现miR-218可靶向调控CDK6和Cyclin D1表达,miR-218通过靶基因CDK6和Cyclin D1调控RB-E2F1通路活性,阻止胃癌细胞G1/S期进程,抑制细胞增殖。而E2F1又能反馈激活miR-218转录。因此,E2F1、miR-218、CDK6/CyclinD1形成负反馈调节环调节E2F活性。 本项目阐明了TET家族具有ceRNA活性,能抑制miR-26活性促进EZH2表达,调促进胃癌发生发展;揭示TET、miR-26、EZH2相互调控机制及其介导的表观遗传修饰在胃癌发生发展中的作用,为进一步阐明胃癌发病机制提供新的理论依据;为TET作为胃癌新的治疗靶点和预后预测标志物奠定实验基础,具有重要的临床应用前景。此外,证实了miR-26a、miR-218在胃癌中发挥抑癌基因功能,是胃癌独立的预后标志。随着未来更深入研究,这些分子可能为胃癌治疗提供新的靶点及预后预测标志物,为胃癌患者带来福音,产生一定的社会影响和较好经济效益。总结研究成果,发表高质量论文2篇。本项目所采用的技术路线从细胞到动物,再到临床样本;从表型到机制;从上游到下游,全面研究TET家族的非编码功能及其在胃癌中的作用;揭示了TET家族与miR-26、EZH2之间相互调控的关系。研究设计上具有层次感和逻辑性;技术路线科学、严谨。首次阐明TET家族作为ceRNA的功能,并阐明TET家族与miR-26、EZH2之间相互调控的关系,这是前所未有的,具有原创性。 虽然本项目中发现TET家族促进胃癌发生发展主要是通过调控EZH2来实验的,但是并不能排除通过其他的靶基因如NOS2,SODD来发挥作用。由于时间和经费的限制,我们未能一一深入研究。这也是本项目所存在的问题。