[00333858]幽门螺杆菌及其毒力因子致病机制的研究

1、H.pylori cagA基因可变区EPIYA酪氨酸磷酸化结构区域的数量的研究。（1）H.pylori菌株临床菌株：收集经胃镜和病理证实的CG（10例）、DU（10例）、GU（10例）和GC（10例）患者胃窦黏膜培养分离获得的H.pylori菌株共40株（现我科已收集并冻存临床菌株62株，其中CG23株，DU16株，GU15株，GC8株）。对照标准H.pylori菌株：我科已收到并冻存英国诺丁汉大学女王医学中心John Atherton 教授赠送以下cagA 基因阳性、cagA 基因阴性和不同vacA 基因型标准对照H.pylori菌株：菌株60190（ATCC 49503），菌株Tx30a（ATCC 51932），菌株93-67，菌株93-72 和 菌株NCTC 11637（ATCC 43504）。（2）应用PCR方法测定临床H.pylori菌株以及标准H.pylori菌株的cagA基因。（3）应用PCR和基因测序方法测定cagA基因阳性临床和标准H.pylori菌株的cagA基因可变区EPIYA酪氨酸磷酸化结构区域的数量。2、测定H.pylori菌株和标准H.pylori菌株与AGS细胞共同培养后，AGS细胞内CagA蛋白磷酸化状况（Western Blotting 方法）。H.pylori菌株重悬在Ham F-12营养混悬液中并稀释，加入AGS人胃癌上皮细胞培养板中，培养后，进行Western Blotting 操作。Western Blotting用抗磷酸化单克隆抗体或抗CagA多克隆抗体。CagA磷酸化程度用Bio-Rad GS-800标刻度的光密度计和量化软件表达成CagA-磷酸化与总CagA磷酸化比率。3、H.pylori及其毒力因子对细胞内信号转导通路影响的研究将临床H.pylori菌株和标准H.pylori菌株及其液体培养液上清分别与AGS细胞共同培养，并进行以下研究：（1）H.pylori菌株及其毒力因子对SHP-2以及Rho家族GTP酶介导的信号转导通路的影响：① SHP-2 活性的测定（Upstate 公司的Kit 测定）；② RhoA活性的影响：RhoA活性的测定（改良Ren法）；③ RhoA与其下游成分ROCK结合的变化 （免疫共沉淀）；④ RhoA相关的基因转录调控：SRE-LUCIFERASE（报告基因）分析；⑤ RhoA相关的细胞骨架、迁移、附着非依赖性生长等改变：a.应激纤维的形成—PHOLLOIDING荧光染色b.迁移率分析（Boyden Chamber Assay）c.软琼脂培养—细胞集落形成等（Anchorage-independent growth assay）⑥ Rac活性的测定（Rac/cdc42 Assay Reagent，upstate公司，NY）⑦Cdc42活性的测定（Rac/cdc42 Assay Reagent，upstate公司，NY）（2）AGS细胞 “蜂鸟”表型改变状况①直接观察H.pylori菌株与AGS细胞共同培养后AGS细胞“蜂鸟”表型改变状况；②应用Src 激酶抑制剂（PP2，C15H16 CIN5，CALBIOCHEN，EMD Biosciences，Inc.USA）阻断CagA蛋白酸磷酸化（CagAP-tyr）、应用小型 RNA干涉 （siRNA）方法阻断SHP-2、RhoA，Cdc42和Rac活性后，观察H.pylori菌株与AGS细胞共同培养后AGS细胞“蜂鸟”表型改变状况。（3）H.pylori菌株及其毒力因子对MAPK介导的信号通路的影响：① Ras活性的改变：用测定药盒（ASK Science Products Inc.产品）；② ERK/JNK/P42/44活性的改变：抗磷酸化ERK/JNK/P42/44抗体-Western lotting；用相关抑制剂（PD98059，U0126等）进一步确认；③ 相关的转录调节因子的活化：凝胶迁移率分析Elk1，AP1等；④ 相关基因表达的变化：c-fos，c-jun（Western Blot，Northern Blot 方法）。4、根据上述结果进行以下分析：（1）不同数量cagA基因可变区域H.pylori 与不同类型临床胃十二指肠疾病的关系；（2）H.pylori 与AGS细胞共培养后，cagA基因可变区域数量与细胞内CagA蛋白磷酸化状况的关系；（3）不同H.pylori菌株及其毒力因子对SHP-2以及Rho家族小 GTP酶介导的信号转导通路的影响；（4）CagA蛋白酸磷酸化（CagAP-tyr）、SHP-2以及Rho家族小GTP酶（RhoA，Cdc42和Rac）与AGS细胞“蜂鸟”表型改变的关联；（5）不同H.pylori菌株及其毒力因子对MAPK介导的信号通路的影响。综合上述研究和分析结果，明确H.pylori毒力菌株；明确H.pylori及其毒力因子在SHP-2、Rho家族小GTP酶和MAPK介导的信号转导通路中的作用；明确SHP-2、Rho家族小GTP酶活性变化与H.pylori致AGS细胞“蜂鸟”表型改变之间的关联；明确H.pylori毒力菌株及其毒力因子的临床致病机制，为临床对H.pylori的治疗和预防提供有价值的理论依据。幽门螺杆菌感染是胃炎（CG）、胃溃疡（GU）、十二指肠溃疡（DU）的主要病因之一，亦是胃癌（GC）和MALT淋巴瘤的危险因素。国际癌症机构已将H.pylori列为Ⅰ级致癌原。世界范围内约有50﹪人群有H.pylori感染存在。但是，在众多的H.pylori感染者中仅少部分H.pylori感染者临床发病。长期以来，H.pylori及其毒力因子的致病机制始终为研究焦点。该研究为H pylori感染后疾病的发生发展提供了线索，有助于加深对H pylori的致病机制的认识。并且为下一步进行机制研究提供了一定的理论依据。以该研究的成果共发表了15篇学术论文；其中3篇被SCI收录，6篇被核心期刊收录。该项目的实施，培养了5名硕士研究生。该项目研究现有起点和科技水平处于国内领先、国际先进水平，具有非常广阔的临床应用前景。