[00333535]细胞因子对人眼小梁细胞MMPs表达及细胞增殖与凋亡的影响

本项目为福建省自然科学基金资助课题（编号：C0510014）等6项科研项目的系列研究成果。 原发性开角型青光眼（POAG）是常见的不可逆性致盲眼病,其发病机制至今尚未完全阐明。眼压升高是目前唯一确定的致病因素,而正常眼内压有赖于房水生成和排出量的动态平衡,房水的排出阻力主要位于小梁网。小梁细胞和细胞外基质的异常均可能影响小梁网的功能,增加房水排出的阻力。 本研究项目在建立人眼小梁细胞体外培养体系的基础上,采用多种先进的实验方法 （1）研究TNF-α、IL-1β两种细胞因子对人眼小梁细胞基质金属蛋白酶（MMPs）表达的影响。 （2）研究小梁细胞外基质成分透明质酸（HA）对MMPs表达及纤维连接蛋白（FN）对小梁细胞增殖、粘附和迁移功能的影响,并探讨了小梁细胞外基质成分相互作用的可能机制。 （3）研究s CD44、表皮生长因子（EGF）两种细胞因子对人眼小梁细胞增殖和凋亡的影响;进一步从细胞功能层面了解细胞因子对小梁网组织这一POAG发病的重要相关部位的作用机制。 本项目研究对探讨POAG的发病机理和抗POAG新药的研发具有一定的意义。 研究结果提示： 1.小梁细胞表达MMP-3及MMP-9,TNF-α在一定范围内促进其表达,且呈浓度依赖性;而NF-κB的特异抑制剂PDTC能下调TNF-α对小梁细胞MMP-3及MMP-9的表达,推测NF-κB可能参与MMP-3和MMP-9转录的启动。IL-1β在一定范围内促进MMP-3的表达,并且呈现一定的剂量依赖性。因此推测细胞因子TNF-α、IL-1β参与青光眼发病机制可能是通过促进小梁细胞MMPs的表达来影响细胞外基质成分,最终影响房水引流状态。 2.POAG小梁细胞表达MMP-2,MMP-9,HA增加POAG小梁细胞MMP-2,MMP-9的表达,在一定范围内呈现剂量依赖性。CD44中和抗体,ERK1抑制剂PD98059能抑制HA依赖性的体外培养POAG小梁细胞MMP-2,MMP-9的表达。POAG小梁细胞表达整合素α5β1以及α4β1,FN能增加其表达并能促进POAG小梁细胞增殖、黏附、迁移能力,且在一定范围内呈现剂量依赖性。证实了POAG小梁细胞外基质成分（HA、FN）自身参与青光眼的发病过程。 3.sCD44在一定浓度范围内抑制POAG小梁细胞的增殖,促进细胞的凋亡,并且呈现一定的剂量依赖性。而EGF在一定的浓度范围内（50ng/ml时）,可以促进小梁细胞的增殖,减缓其凋亡;当浓度增加到一定的程度时（100ng/ml）,其促进增殖作用有所下降。 本项目的先进性和创新性： 1.本研究创新性的利用小梁切除术中取得的带小梁组织块,在体外成功培养POAG小梁细胞。该研究目前国内外尚未见同类报道,研究水平达国内领先水平。而本课题组后期采用正常人眼小梁细胞和POAG小梁细胞进行对照实验研究,也使得研究结论更为全面和可靠。 2.创新性的采用NF-κB的特异抑制剂PDTC抑制NF-κB的活化,观察TNF-α对MMPs-3, MMP-9表达影响的变化,研究结果表明TNF-α在一定范围内促进小梁细胞MMP-3及MMP-9的表达,且呈浓度依赖性;而NF-κB的特异抑制剂PDTC能够下调TNF-α对小梁细胞MMP-3及MMP-9的表达,推测NF-kB可能参与MMP-3和MMP-9转录的启动,这可能是TNF-α参与原发性开角型青光眼发病的机制之一。 3.采用RT-PCR法及ELISA法检测不同浓度IL-1β对小梁细胞MMP-3表达的影响。研究结果表明IL-1β在一定范围内促进MMP-3的表达,并且呈现一定的剂量依赖性。根据上述实验结果推测细胞因子TNF-α、IL-1β参与青光眼发病机制可能是通过促进小梁细胞MMPs的表达来影响细胞外基质成分,以影响房水外引流状态。经查新检索,该研究成果目前国内外尚未见同类研究报道。 4.采用RT-PCR和酶谱分析法检测不同浓度HA对体外培养传3代POAG小梁细胞MMP-2,MMP-9表达的影响;运用CD44抗体,MEK1的抑制剂PD98059抑制HA-CD44信号通路的活化,观察MMP-2,MMP-9表达量的变化。采用免疫细胞化学法检测不同浓度FN对体外培养POAG小梁细胞整合素α5β1以及α4β1表达的影响。研究结果表明POAG小梁细胞自身表达MMP-2,MMP-9及整合素α5β1和α4β1;HA上调MMP-2,MMP-9的表达,并在一定范围内呈现剂量依赖性。CD44中和抗体,ERK1抑制剂PD9805传3代POAG小梁细胞增殖、粘附与迁移的变化,表明FN能促进体外培养POAG小梁细胞增殖、黏附、迁移能力,并在一定范围内呈现剂量依赖性;采用CCK-8法、荧光显微镜和流式细胞仪检测经不同浓度sCD44、EGF干预,对传3代POAG小梁细胞增殖与凋亡的影响,表明sCD44在一定浓度范围内可以抑制POAG患者小梁细胞的增殖,促进细胞的凋亡,而EGF促进POAG患者小梁细胞的增殖,抑制细胞的凋亡,并且呈现一定的剂量依赖性。综上,可推测细胞外基质成分（FN）及细胞因子（EGF,sCD44）可能通过影响小梁细胞功能和数量间接参与POAG的发病过程。经查新检索,该研究成果目前国内外尚未见同类研究报道。本研究对探讨POAG的发病机制和新药的开发应用具有一定的意义和临床应用前景。本系列研究共发表SCI论文、核心期刊论文共13篇已被SCI源等核心期刊引用达18篇次,研究总体水平达国内领先水平。