[00272090]用于同时检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物及其设计方法

　　项目简介：

　　本发明涉及一种扩增副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物及其设计方法，设计方法包括以下步骤：步骤1，利用引物设计软件设计一系列同时扩增副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物组合；步骤2，对一系列引物对进行筛选，选择扩增效果最佳的引物组合；步骤3，对选择好的最佳引物组合进行反应条件摸索；步骤4，对建立的方法进行特异性、重复性和稳定性等摸索。本发明解决副溶血弧菌和溶藻弧菌检测过程中常规细菌分离检测周期长的问题，而且同时检测两种菌，具有快速、特异、敏感、节约费用等优点。

　　项目核心创新点：

　　为了解决快速检测进出口水生动物及其产品中的副溶血弧菌和溶藻弧菌，本发明提供一种用于同时检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物及其设计方法，该PCR引物在同时检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的应用中具有简单、灵敏、快速、特异的优点。

　　为了实现上述目的，本发明的解决方案如下：

　　用于同时检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物，副溶血弧菌引物对应的PCR扩增片段大小为208 bp，溶藻弧菌引物对应的PCR扩增片段大小为159 bp，具体引物序列如下：

　　V.para.（ToxR）F1：5’- CGAAAGCCGTATACTCCTGATG -3’

　　V.para.（ToxR）R1：5’- GAGTTGATAGCCTCGTTTTGGA -3’

　　V.algi.（ToxR）F1：5’- GATCGTTTTGACCTGCGAAA -3’

　　V.algi.（ToxR）R1：5’- GCATTGAGCGCTACGTGAA -3’。

　　备注：在本专利文本中，V.para.为副溶血弧菌的英文缩写，V.algi.为溶藻弧菌的英文缩写；V.para.（ToxR）F1 和V.para.（ToxR）R1为根据副溶血弧菌ToxR基因设计的上游引物F1和下游引物R1；V.algi.（ToxR）F1和 V.algi.（ToxR）R1为根据溶藻弧菌ToxR基因设计的上游引物F1和下游引物R1。

　　用于同时检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物设计方法，该方法包括以下步骤：

　　步骤1，利用引物设计软件设计同时检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为20- 24个，引物的熔解温度Tm值为56℃-63℃，引物的GC%为40%-60%；

　　步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不能合成引物二聚体的引物；

　　步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC%和碱基数进行比较，当引物的碱基数均相同且内侧引物的GC%小于外侧引物的GC%，或者当引物的碱基数不完全相同且内侧引物的碱基数比外侧引物少一个碱基时，判断为竞争状态劣引物，进行步骤4；否则判断为竞争状态优引物，进行步骤5；

　　步骤4，再次筛选竞争状态劣的引物，具体步骤为：重复步骤2，对所保留的引物按照步骤3进行再次判断；

　　步骤5，利用PCR方法对竞争状态优引物进行扩增；

　　步骤6，去除扩增引物中的劣引物，获得多重PCR引物。

　　步骤1中，所述所用的引物设计软件为Primer2.0、Primer5.0或0ligo6.0。所述多重PCR引物组合的熔解温度Tm值为60℃。

　　步骤1中，所述不能形成引物二聚体的引物的碱基数目为22或23。

　　步骤2中，所述对引物组合中的引物进行筛选，具体为：对所用的引物进行PCR扩增，筛选扩增效果最好的引物组合。

　　步骤5中，所述PCR方法的富集阶段的退火温度为60-65℃，标记阶段为94℃变性，72℃退火延伸的两步PCR，扩增阶段的退火温度为50-60℃。

　　本发明的有益效果如下：

　　采用本项目建立的多重PCR技术同时检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，具有操作简便、快速，特异性强，灵敏度高等优点,只需一个PCR反应就可同时检测出副溶血弧菌和溶藻弧菌，通过应用该方法对进口冷冻带鱼、鱿鱼和墨鱼，活甲鱼、甲鱼蛋、螃蟹和虾等100份样品的检测，同时与常规方法检测进行比较。多重PCR方法检测出3份样品为副溶血弧菌阳性和5份溶藻弧菌阳性，与常规细菌分离鉴定结果完全吻合。该方法的成功研制，大大加快了副溶血弧菌和溶藻弧菌的检测。

　　项目详细用途：

　　副溶血性弧菌和溶藻弧菌均属弧菌科弧菌属，是通过食物、水传播的病原菌，具有相似的生物学特性和同样的致病性，均可引起腹泻和食物中毒。

　　副溶血弧菌最早是由Fujino等于1953年从日本一个食物中毒患者初次分离得到的，又称嗜盐菌，该菌因在含食盐较浓(3%-4%以上)的培养基中能生长，而在不含盐的培养基内不能繁殖而得名。副溶血弧菌分布于世界各地，通常存在于海湾和海岸线区域以及海产品中，人多因食用污染本菌又未经良好加工的海产品如蟹类、牡蛎!虾等而引起食物中毒。副溶血弧菌引起的食物中毒，在细菌性食物中毒中占的比例很高，其危害仅次于沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌和肉毒梭菌。我国沿海地区每年都有因副溶血性弧菌引起食物中毒的报道。人中毒后的基本症状包括：腹泄(呈水样便或血样便)、腹部痉挛、恶心、呕吐和头疼，也曾有发烧和发冷的报道，但较少。

　　溶藻弧菌属专性嗜盐性弧菌，其致病性主要是引起肠道外感染。近年来，国内外报道溶藻弧菌引起急性腹泻和食物中毒病例日益增多。溶藻弧菌广泛分布于自然界，尤其以海产品携带率最高，是引起细菌性食物中毒的一种重要致病菌。目前细菌性食物中毒在食源性疾病发病率中仍占较高的比率。沿海一带由于人们喜食海产品，因此溶藻弧菌食物中毒发病率较高。世界上各个国家食品卫生法规中均把该菌列入法定检测项目，一经发现禁止进口和出口。

　　目前，美国和欧盟对进口水产品都强制性要求进行副溶血弧菌的检测，检验结果为阴性方可通关，否则出口的水产品将被全部自动扣留或就地销毁。这给我国水产品的出口设置了技术壁垒。因此，出口水产品加工厂认真贯彻HACCP计划，加强对副溶血弧菌的检测，检疫部门加强对工厂落实HACCP计划情况的监管和对出口水产品的检验就显得尤其重要。

　　目前，国内对于副溶血性弧菌的检测已经有了相应的国家标准和行业标准，方法大致分为以下几个过程:(1)前增菌；(2)选择性增菌；(3)选择性培养；(4)生化鉴定；(5)神奈川现象和血清学实验。检验过程需要5d~6d才能报告阳性结果。检验方法繁琐，费时费力，不仅影响检验机构的工作效率，而且使生产部门的产品运输和仓储时间延长，生产成本加大。而对于溶藻弧菌的检测还没有建立相应的标准，只是参照副溶血性弧菌的检测方法。因此，建立建立简便、快速的检测方法非常必要。

　　聚合酶连是反应（Polymerase Chain Reaction,简称PCR）是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的分子生物学技术。一个反应常有25-35个循环，一个循环包含3个步骤，首先使模板DNA双链在94-95℃变性为单链，然后在较低温度下，使引物与模板结合，接着在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA互补链。可看作生物体外的特殊DNA复制。一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段。多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂盒操作过程与一般PCR相同。多重PCR是在普通PCR的基础上加以改造，于一个PCR反应体系中加多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。多重PCR在一次反应中就能同时扩增一个基因的多个靶序列。多重PCR最先是在1988年就被Chamberlain所提出，在这短短22个年头之内，它已经在DNA检测的多个领域得到成功的应用。具体包括检测基因突变、缺失等多态，定量PCR，反转录PCR。Henegariu在1997年设计出了多重PCR步步优化协议，指导怎样多重PCR的反应体系。但是多重PCR最大的问题还是存在于引物的设计上。和一般PCR相比较，多重PCR在同一PCR反应管内同时扩增出多个病原的基因片段，一次完成多个模板的扩增。多重PCR的系统性主要体现在它能够根据需求一次性扩增出所有的相关基因。在本发明中，在统一反应管内同时检出副溶血弧菌和溶藻弧菌，将大大节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。由于多重PCR的引物设计要求总体上跟一般PCR的引物是一致的。如引物本身不能有稳定二级结构（发夹和二聚体），引物之间也不能有稳定的二级结构等。但是多重PCR要将两对以上的引物放在一起，并且扩增出所有的目的片段，这对引物又提出了更高的要求，对引物之间的相互作用要求更加严格。因为经常是扩增目的各引物单独扩增的时候都能很好的工作，扩增出条带清晰的目的片段，但是混在一起的时候就出现条带丢失现象。各引物之间还存在竞争关系，强势引物可能掩盖弱势引物，导致片段丢失。更有甚者，引物相互作用产生严重的引物二聚体，根本扩增不出一条目的片段。

　　多重PCR检测技术在一次反应中就能同时扩增一个模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。以其快速、高效，特异性好、灵敏度高的特点，在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用；但多重PCR在提高食品微生物检测灵敏度、去除食品抑制因子的干扰，提高卫生标准及加强技术人员水平上仍有许多问题需要解决。多重PCR改进技术简化了食品微生物检测过程、缩短检测时间、降低检测成本同时提高了食品微生物检测的灵敏度；但是多重PCR的改进技术也存在一定问题。未来的研究主要集中在改进样品前处理技术、去除食品抑制因子干扰，其次是多重PCR与其它技术的整合应用，如多重PCR与变性梯度凝胶电泳、基因芯片、荧光探针定量技术、免疫磁珠吸附等技术结合应用，进一步提高食品微生物检测的灵敏度、可重复性，实现大批量食品检测、复杂样品基质中的多种微生物的有效检测、食品微生物检测的标准化，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。

　　PCR是一种模拟体内DNA复制过程的技术，由于具有快速、特异和敏感等特点，近年来在猪病诊断上得到广泛应用。多重PCR是一种特殊PCR形式，比单一PCR反应更快捷、更节约，其最突出的特点，即一次PCR反应，可同时检测、鉴别出多种病原体，在临床混合感染的鉴别诊断上具有其独特优势和很高的使用价值。

　　多重PCR技术的应用，可大大减少检测成本，可大大减少工作量，适应于口岸快速检测的需要，是一种准确、可靠、科学的分子生物学方法。有鉴于此，尽快开发一种用于同时检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重PCR势在必行。这对于加强进出口水产品中弧菌的快速检验检疫、水产养殖病害的调查和防治、无公害水产品检测和生产以及水产品卫生质量监督检验等方面都具有十分重要的意义。

　　预期效益说明：

　　多重PCR技术同时检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，具有简单、灵敏、快速、特异等优点，能大大方便口岸进出口货物的通关速度。这对于预防和控制我国水产品安全具有重要的现实意义。目前未见国内外利用该技术检测进出口水生动物及其产品中副溶血性弧菌和溶藻弧菌的报道，该技术有望为出入境副溶血性弧菌的检测提供一种快速灵敏、简便可靠的方法，特别适合口岸检疫部门实施快速验放需要，具有较好的社会效益和经济效益。