[00244149]高活性固定化酶的开发应用技术

一、课题来源与背景 生物催化技术是带动21世纪世界经济发展的关键技术之一，它将为解决世界所面临的能源、资源和环境保护等问题开辟新的途径。工业催化中以生物酶为代表的催化剂正在取代以传统化学催化剂为主的化学工业，酶催化的高效性和高选择性可以完成传统化学所不能胜任的位点专一性、化学专一性、立体专一性等催化。以性能优异的固定化酶取代游离酶的使用，无疑是进一步提高酶和生物催化领域的生产技术水平和生产效益的新途。固定化酶的使用，将为酶催化制备化学品的提供高效的生产技术。 项目针对固定化酶在工业化生产中应用所面临的两大关键技术：1）高活性与稳定性兼备；2）可重复使用且工艺简易，依据青霉素酰化酶和脂肪酶两种工业用酶自身的性质，设计制备了适合于两种酶固定化载体，从而获得高活性和重复使用好的固定化酶，形成了酶催化制备几种手性化学品的合成技术。 二、技术原理及性能指标 1、固定化载体和固定化酶的制备 酶依据青霉素酰化酶和脂肪酶自身的亲水与疏水性质，系统研究制备出两种磁性聚合物微球，亲水性磁性微球（MPS-Q）和疏水性磁性微球（MPS-S）。 SEM、TEM、振动样品磁强计和BET等对微球进行表征,合成的MPS-Q特性为：球直径~200?m、平均孔径15-30nm，比表面积120-160m2/g，具有超顺磁性，饱和磁化率为4-11emu/g，环氧基团0.3-0.8mmol/g;MPS-S特性为：直径约为100?m微球，平均孔径25-30nm,比表面积40-80m2/g,具有超顺磁性，饱和磁化率为3-7emu/g,环氧基团在0.3-0.6mmol/g范围。二者表面存在的环氧基共价偶联酶分子实现酶的固定化。 制备了Fe3O4微球为核、生物兼容性SiO2为壳、饱和磁化率达3-7emu/g的无机复合物。利用有机硅试剂对其表面修饰，嫁接一定数量能与酶共价偶联的氨基，通过戊二交联获得共价组装固定化酶。 研制的MPS-S固定化脂肪酶的表观水解活性618U/g,Fe3O4@SiO2-NH2表观水解活性1130U/g;MPS-Q固定化青霉素酰化酶的表观水解活性为643U/g. 2、固定化酶合成手性化学品 （1）(S)-2-氯苯甘氨酸是合成手性药氯吡格雷的关键中间，体MPS-Q固定化青霉素酰化酶催化水解N-苯乙酰-2-氯苯甘氨酸制备99.3%对映体过量值的(S)-2-氯苯甘氨酸。 （2）Fe3O4@SiO2-NH2固定化脂肪酶催化(R,S)-对溴-1-苯乙醇转酯化拆分技术，得到的(S)-对溴-1-苯乙醇和(R)-乙酸对溴-1苯乙酯的对映体过量值均为99.0%，制备出高光学纯手性单一对映体。 （3）Fe3O4@SiO2-NH2固定化脂肪酶催化2-芳基-4-羟基四氢吡喃类化合物拆分，如2-苯基-4-羟基四氢吡喃、2-(4-氯苯基)-4-羟基四氢吡喃和2-(4-甲基苯基)-4-羟基四氢吡喃，获得相应手性单一对映体的对映体过量值均高于92.0%。 （4）建立了化学-酶合成2-(4-氯苯基)-4-羟基四氢吡喃单一对映体的合成方法，相应手性体的对映体过量值高于95%。 三、技术的创造性与先进性 项目以全新的聚合反应体系和制备方法开辟特效功能材料的制备途径，获得了高效的固定化载体和高活性固定化酶，设计思想与制备方法对其它酶固定化技术的研究有重要的指导和借鉴作用，具有独创性。形成的对溴-1-苯乙醇、2-芳基-4-羟基四氢吡喃和2-氯苯甘氨酸甲酯等多种手性化学品的生物合成方法，技术先进，为企业产品更新换代提供了实验基础和技术支持。发明的磁性固定化酶在磁场中能够快速沉降，简化了分离步骤，从根本上解决了使用中固定化酶在分离和洗涤过程的流失问题。 四、技术的成熟程度，适用范围和安全性 目前利用化学法获得的医用效果独特专有的手性化合物的品种少，产量低，光学纯度差，生产效率低下（副产物多，环境污染严重），远不能满足医药、农药和精细化学品产业发展的需求。该项目研究出的固定化脂肪酶在有机反应体系中具有高活性和优异的操作稳定性，合成手性化学品达到光学纯度，技术成熟，应用价值突出。发明的固定化酶制备工艺为常规化学反应工艺，所采用的分批间歇操作工艺和固定床反应设备，为化工生产中普遍采用的工艺和设备，并为中小型化工生产企业所常用的，整体工艺过程操作简便，具有很好的安全性和环境效益，这些优势一定会促使研究成果的推广应用。固定化酶催化反应的产品，为化学方法不易制备或不能制取的应用价值高、医用效果独特专有的单一手性化学品，这些化学品价格高，产生的经济效益将十分显著。 项目形成的科技资源和成果可向全区及国内推广，研究成果的知识产权可以市场化运作推广。 五、应用情况及存在的问题 获得的固定酶催化合成多个手性化学品的制备技术，涉及面宽，体系较完整，但深入揭示酶催化反应体系共性的技术问题尚不足。项目中酶催化合成的手性化学品工艺技术先进，但合成的化学品主要为合成药物的关键手性中间体，并非成品药。下一步将进一步加大成果的应用推广，同时以此项目手性化学品为原料，进行成品药的开发。 六、历年获奖情况 指导研究生曹雪荣毕业论文"磁性聚合物固定化青霉素和脂肪酶的催化性能"，获自治区优秀高等学校优秀硕士论文，2011-12.