[00243768]环介导等温扩增技术（LAMP）快速诊断羊支原体性肺炎

该项目来源于宁夏农林科学院先导基金，属于兽医分子生物学诊断技术，应用于规模化羊场的支原体性肺炎的快速诊断。 本研究针对已报道的绵羊肺炎支原体和丝状支原体簇保守的16S rRNA基因设计了2套特异性的引物，利用LAMP技术扩增基因组DNA，建立了羊支原体性肺炎快速LAMP检测技术，并初步应用于规模化养羊场支原体性肺炎的检测。主要研究结果如下： 1.根据16S rRNA基因序列，应用PrimerExplorer 4.0设计引物，同时应用BLAST程序，通过GeneBank对各引物及扩增产物进行同源性比对，获得2套特异性LAMP引物: 绵羊肺炎支原体：F3:5'-CATGCCTCTTACGAGTGG；B3:5'-CAACTCCCATGGTGTGAC；FIP:5'-CCGAACTGAGACTACTTTTTTGAGA-TTTT-CACGTGCTACAATGGCTAC；BIP:5'-ATTGAAGTCTGCAACTCGACTTC-TTTT-GAGAACGTATTCACCGCA； 丝状支原体簇：F3:5'-GAACGGGTGAGTAACACG；B3:5'-CGATCAACCTCTCAGTTCG； FIP:5'-GCGATAATAAGATCTACATGCGGT-TTTT-TATCTAACCTACCTCATAGCG；BIP:5'-TTGGTTCACTATGAGATGGGGA-TTTT-GCTACGTATCATCGCCTAG； 2.优化了LAMP反应条件，结果表明最佳反应条件为:25μL体系,0.2 M betaine，8 mM Mg2+，1.4 mM dNTPs，2.5μL 10×Bst Buffer，120 μM HNB，8 U Bst DNA聚合酶大片段，1 μL模板，外引物各0.2 mM，内引物各1.6 mM；最佳反应条件为65 ℃，60 min。 3.引物的特异性试验表明，LAMP检测绵羊肺炎支原体，对绵羊肺炎支原体标准株Y98及地方分离株NX01、SC01-06均为阳性，对丝状支原体山羊亚种标准株PG3、丝状支原体丝状亚种LC型标准株Y-goat、山羊支原体山羊肺炎亚种甘肃地方分离株M1601株、精氨酸支原体、巴氏杆菌、大肠杆菌、牛支原体、溶血性曼氏杆菌分离株PmGS均为阴性。LAMP检测羊丝状支原体簇的成员，丝状支原体山羊亚种标准株PG3、丝状支原体丝状亚种LC型标准株Y-goat；山羊支原体山羊肺炎亚种甘肃地方分离株M1601株均为阳性，检测绵羊肺炎支原体标准株Y98、精氨酸支原体、巴氏杆菌、大肠杆菌、牛支原体、溶血性曼氏杆菌分离株PmGS均为阴性。以上结果表明，2套LAMP引物特异性好。 4.敏感性试验表明，对绵羊肺炎支原体标准株Y98总DNA的LAMP灵敏性检测为100 pg/μL；对丝状支原体山羊亚种标准株PG3总DNA的LAMP灵敏性检测为10 pg/μL。 5.LAMP的组内重复性和组间重复性均较好，表明LAMP方法的稳定性好。 6.依靠肉眼观察反应管中焦磷酸镁沉淀产生或加入羟基萘酚蓝（HNB）观察颜色变化对结果进行检测，不仅可以节约电泳时间，还可最大程度降低开盖检测产生污染的缺点。 7.在宁夏各地采集羊场疑似羊支原体感染病羊的鼻腔拭子和/或新鲜肺脏组织20份，其中鼻拭子16份，肺脏4份。PCR检测到绵羊肺炎支原体阳性标本9例，LAMP阳性9例，二者符合率100 %，说明LAMP检测方法准确性好。 项目建立的LAMP检测方法，反应在65 ℃，60 min一步完成；该方法的建立，使临床上对羊支原体性肺炎的检测由数天缩短至2 h，且准确率、灵敏度和特异性均良好。在实际应用中，依靠肉眼观察反应管中焦磷酸镁沉淀产生或加入羟基萘酚蓝观察颜色变化对结果进行检测，不仅节约电泳时间，还可最大程度降低开盖检测产生污染的缺点；试验过程仅需一台恒温水浴锅等简单设备，大大减少了设备等试验条件要求。项目建立的检测羊支原体性肺炎的LAMP方法，为早期诊断羊支原性肺炎，防制该病的发生和蔓延提供有力工具，为我区养羊业的健康养殖和稳定发展发挥重要的作用，具有很好的应用前景。 项目首次开展了环介导等温扩增技术应用于羊丝状支原体簇诊断的研究；项目开展了通过颜色变化判定LAMP产物的研究，为该项目的创新之处。 存在的主要问题和改进意见： LAMP灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，加上目前国内大多数实验室不能严格分区，假阳性问题比较严重。建议规范LAMP的实验室操作，DNA提取，反应体系的配制，LAMP扩增，LAMP产物的检测分区进行。在现有的实验室，划分相对独立的区域，避免出现LAMP假阳性。