本发明公开了一种特异性识别铜离子的多肽荧光探针及其制备和检测方法。其包括:(1)多肽探针的设计:新型的多肽探针,特征包括:①、多肽序列可以靶向结合Cu2+;②、多肽序列的N端修饰发光物质;(2)多肽探针的制备:固相合成特定序列的多肽,再将发光物质修饰到该多肽;(3)体外检测:包括:①、多肽探针的离子选择性;②、多肽探针的铜离子结合比;③、多肽探针的pH响应性;④多肽探针的检测限;(4)细胞成像。本发明设计的一种新型多肽探针,对金属铜离子具有良好的结合能力,选择性好、毒性低、检测限低,而且制备简单、检测方便,为生物和环境样品中的铜离子的快速检测提供了一种高效的方法。