本发明公开一种梯度致密性荧光水凝胶及其制备方法和应用。所述水凝胶包括A液及B液,A液:取0‑4重量份多聚甲醛、0.8重量份NaCl、0.3重量份Na2HPO4·12H2O、0.02重量份KCl和0.02重量份KH2PO4,去离子水定容至NaCl浓度为0.008g/ml后55℃溶解;冷却至4℃后调节pH至6.8‑7.6;加入0.025‑0.15重量份荧光微球、5‑15重量份丙烯酰胺、0.025‑0.075重量份N,N‑亚甲基二丙烯酰胺,4℃溶解后加入0.078重量份四甲基乙二胺和0.05‑0.2重量份过硫酸铵并震荡混匀。该水凝胶具有超强的耐组织透明处理性,可对大组织内的血管结构进行稳定荧光标记。