本发明公开以转酮醇酶基因为靶标检测绵羊肺炎支原体的组合物、试剂盒和方法。本发明的组合物的检测靶标为绵羊肺炎支原体的转酮醇酶基因,可以针对该基因中的多种不同片段,并且通过实验验证了本发明的组合物可设计出多种不同具体组合情形以应用于传统PCR、basic RPA、nfo RPA和exo RPA等多种扩增方法,另外可借助琼脂糖凝胶电泳、侧流层析试纸条以及恒温荧光扩增仪来观察实验结果。本发明对检测过程中最佳反应时间与最佳反应温度、检测的特异性、敏感性、重复性和稳定性均进行了探索,找到了最佳反应条件,建立了特异性好、敏感性高且可以稳定重复的绵羊肺炎支原体快速检测方法,具有操作简单,便捷省时,无需大型的实验仪器设备。